在线药店销售的不需要处方的抗菌药物的多因素质量和安全性分析:多相观察、含量分析和产品评价研究

简介

抗微生物药物耐药性(AMR)的日益蔓延是一项全球公共卫生和安全威胁，日益受到公共卫生从业人员、临床医生和政策制定者的关注[1]。世界卫生组织(世卫组织)估计，到2050年，由于抗微生物药物耐药性，预计每年将增加1.2万亿美元的卫生支出[2]。最近的一项系统分析估计，单是2019年，抗生素耐药性就直接导致127万人死亡[3.]。因此，抗菌素耐药性在未来的健康、环境和经济成本已使其成为需要解决的优先全球卫生问题[4]。

抗生素耐药性的增长受到若干因素的推动，包括处方抗生素的滥用和过度使用，这些处方抗生素可能没有得到合理的处方或受到充分的专业监督，包括非处方或非处方配药，以及可能从未经授权的渠道非法采购[5-7]。这包括通过互联网销售的抗生素，有记录的直接面向消费者的销售可以使患者选择他们的剂量、治疗时间和治疗类型，并使供应商能够在不需要有效处方的情况下分发产品[8-11]。这些网上药店也可能成为病人接触不合格和假药的渠道，抗感染类药物被广泛报道为假药并在网上出售[6，12-15]。

由于从事可疑采购的网上药店造成了明显的公共健康风险，以往的研究主要集中在对抗生素购买行为进行调查，或检查网上卖家的特征和抗生素产品的一般可得性，以更好地表征风险。例如，2009年发表的一项关于该主题的早期研究发现，通过在谷歌和雅虎搜索引擎上进行“无处方”相关关键词搜索，有138家供应商在没有处方的情况下销售抗生素，并销售几种抗生素治疗类[16]。2017年发表的一项最新研究通过确定英国20家提供抗生素销售的独特在线药店，强化了这些结果，其中45%不需要有效处方[6]。此外，2020年的一项研究对中国的在线药店和社区药店进行了全国性的横断面评估，发现79%的在线药店不需要有效处方[7]。虽然这些研究提供了重要的经验证据，并重申使用互联网作为不受监管的和潜在非法的抗生素获取点，但据我们所知，没有研究使用这些方法的组合来评估所提供产品的实际产品安全性和质量特征。

作为回应，本研究扩展了之前的研究，首先确定并描述了销售处方抗生素的在线药店，并特别关注常见药物。然后，我们对从“无处方”网上药店检测到的抗生素进行测试购买，并对包装和产品进行目视检查，以排除可能存在的安全问题。最后，本研究利用质谱(MS)和分子网络对抗生素样品进行化学分析，以评估质量特征和可能的风险指标。

方法

概述

该多因素风险和质量评估分3个阶段进行(图1）.第一阶段使用结构化搜索引擎查询来识别和描述出售常见抗生素的“无处方”在线药店。第二阶段利用第一阶段确定的网站对抗生素进行受控测试购买，并对包装和内容物进行目视检查，以进行风险评估。第三阶段也是最后一个阶段涉及使用超高高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱非靶向质谱对对照试验购买阶段购买的抗生素进行检测。这项研究没有涉及对人类参与者的研究。我们将在下面详细描述每个阶段。

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结构化网页搜索

为了确定无处方销售常见抗生素的网站和特定供应商，我们根据美国疾病控制和预防中心的数据(“定向抗生素”)，选择了美国门诊处方的前5种口服抗生素(阿莫西林、阿莫西林和克拉维酸、阿奇霉素、头孢氨苄和环丙沙星)，因为它们构成了本研究重点范围内的常用抗生素[17]。使用谷歌搜索引擎进行结构化查询，删除cookie文件，并在Chrome浏览器中选择隐身隐私设置。关键词搜索包括以下内容:“在线购买[抗生素]”和“无处方购买[抗生素]”，使用与其他已发表研究类似的协议，重复了所有5种靶向抗生素(多媒体附件1) [6，18]。在搜索结果的前10页中填充的所有url或超链接都被包括在内进行分析。搜索是在2018年4月至5月期间进行的。

在通过对返回的URL或超链接进行编目来整理搜索引擎结果后，我们首先消除了所有重复的结果，然后进行网站内容分析，以识别和分类符合标准的网站网上药店-声称以互联网药房的方式运作的网站，包括一个电子商务购物车，可以直接面向消费者购买(见多媒体附件1其他经评估的网站分类)[6，8，19，20.]。url或网站被归类为网上药店然后人工检查，以确定他们是否需要有效的处方才能下订单。这包括评估该网站是否声称是“无处方”在线药店，并确认在订购过程之前是否需要有效处方，或者该网站是否不需要处方或声称使用医疗问卷来代替处方要求。

我们还通过交叉引用外部公共和私人验证数据源评估了网站或URL的总体有效性，包括LegitScript(一种基于网络的服务，用于监控在线药店是否遵守适用的法律法规，并对非法和合法网站进行分类)，全国药房协会(NABP)不推荐名单，以及根据2011/62/EU指令引入的用于在线药品销售的欧盟(EU)标志(“欧盟通用标志”)。为了进一步识别和描述被审查网站的潜在位置(物理地址和IP地址)和所有者，我们还交叉引用了互联网名称与数字地址分配公司(WHOIS查找工具)的数据，以评估每个URL的注册商、注册人名称、注册人国家、注册人地址、IP地址和IP服务器。2018年5月至6月对网站进行内容分析。

受控测试采购和目视检查

网站分类完成后，在我们的对照试验购买阶段，使用研究纳入和排除标准协议(多媒体附件1）.从2018年7月开始，我们开始从据称销售5种靶向抗生素中至少一种的在线药店进行有控制的采购。为了避免从多个在线药店或附属网站的同一所有者或组下订单，我们检查了在线药店名称、网站内容、联系信息的相似性，并在网站源代码(JavaScript)下划线以删除潜在的重复。这产生了一个较小的网站样本，构成了我们测试购买过程的最终一组网站。

基于最终生成的一组在线药店，所有针对抗生素的广告都是按包装销售的(例如，15片/包，30片/包)，包装中的药丸数量和价格各不相同。为了产生足够的样品用于第三阶段的分析质量测试，我们从每个选定的在线药店为每种产品购买了至少20粒药丸，并为有效成分的剂量设定了最低标准(多媒体附件1）.购买始于2018年8月，使用预付Visa现金卡进行，发货订单设置为美国西海岸的两个独立住宅邮寄地址。所有订单报表、确认邮件和Visa现金卡对账单的交易都被记录了下来。

收到包裹后，我们对包装进行目视检查，进行初步风险评估。通过交叉引用可用的订单信息、购买的特定目标抗生素和现金卡交易记录，并将所有样品拍照、编目并存储在安全位置，将包裹与在线卖家匹配。然后对外部包装进行物理检查，以确定已知的产品伪造风险特征，然后打开以检查和确认根据泡罩包装上的信息购买的抗生素(表1）.我们注意到，所有的包装，无论原产国，都在吸塑包装和标签上有英语标记。然后，我们将每个样品包分为两组，第一组作为备份和参考样品，第二组用于研究的第三阶段的分析质量测试。

分析质量测试

在对照试验阶段收集的靶向抗生素，然后准备用于分析测试，并通过超高高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱，使用非靶向质谱进行分析(多媒体附件1）.在有机溶剂中粉碎和提取药物配方，并与从美国药典获得的活性药物成分(API)标准进行比较。半定量结果-定义为随时间的综合MS信号，产生反映量但不能用于确定绝对物理量或浓度的峰值面积-用于确定样品中是否存在所声称的抗生素API。分子网络利用全球天然产物社会分子网络平台[21]对正、负模式下的MS/MS数据进行分析。分子网络评估和连接相似的MS/MS光谱，这意味着化学物质的分子结构是相似的。

使用超高性能液相色谱仪(Vanquish, Thermo)结合Orbitrap质谱仪(QExactive, Thermo)收集靶向抗生素样品的数据。在Xcalibur (Thermo)中创建了一种处理方法，以整合所测试的药物配方中声称存在的api的值(使用MS1数据)，包括由供应商主动发送给研究成员的西地那非和他达拉非样品。通过MS/MS从头注释支持的特殊文库匹配，发现配方中存在一些药物类似物以及掺假和污染物。

结果

网上药店特点

我们收集了109个唯一URL(从总共135个URL中)，其中98个(89.9%)被归类为在线药店，21个(19.3%)在线药店注册了一个以上的URL。这些网站中绝大多数(n=85, 78.0%)被Legitscript归类为“流氓”或“未经批准”，62个(56.9%)在NABP不推荐名单上。此外，只有19个(17.4%)有欧盟共同标志(表2）.此外，根据现有的WHOIS数据，有20家(18.3%)使用了市售域名屏蔽和增强隐私服务来隐藏其位置和所有权。在拥有可用位置数据的网站中，注册地点最多的5个国家是美国、俄罗斯、巴巴多斯、加拿大和英国，不过注册地点还包括北美、南美、欧洲和亚洲等更广泛的国家。在应用我们的纳入和排除标准选择测试购买后，选择了27家在线药店进行对照测试购买。

受控购买结果和包装分析

向27家在线药店下了订单，结果收集了1373个抗生素产品样品。本研究将产品样品定义为从发送给研究团队的包装中收集的单个药丸或胶囊，包装主要由不同数量的药丸或胶囊的水泡包装组成。在订购过程中，我们收到了来自供应商的电话和电子邮件，以确认订单细节，但电话没有接听，但研究团队成员只是通过确认订单细节来回复供应商的电子邮件。一些在线药店包括要求客户验证与信用卡发卡银行交易的电子邮件，包括可疑验证请求的电子邮件(例如，“如果支持银行可以联系您进行验证付款，请不要告知从XXX药店购买药品的情况。”你可以告诉他们你支付了“家庭照片转换成CD和闪存驱动器，或网站设计等”)。

在所有27个订单中，只有13个(48.1%)是通过网站的在线订购流程成功完成的，从而导致了确认交易。然而，这些交易中有2笔(7.4%)导致欺诈(例如，在其他电子商务交易中，欺诈购买是使用提供给在线药店的Visa现金卡信息进行的)，我们没有从这些供应商那里收到产品。在剩余的成功完成的交易中，收到了11个包裹，根据运输标签和记录，10个(91%)从印度发货，1个(9%)从新加坡发货，除了1个(9%)包裹是用信封发货的(即1个包裹是用小盒子发货的)。除了订购的靶向抗生素外，2包(18.2%)还包括其他通常用于或指示用于勃起功能障碍的主动处方药(如柠檬酸西那非)。

对包装和样品进行了检查，以了解所谓制造商的名称、产品警告(例如，仅不含“Rx”)以及任何表明产品真实性的认证或标志。两个信封收到时有明显的损坏，打开时装有损坏的胶囊。根据进一步的包装分析，我们发现在抗生素中，产品特征(如颜色、形状、泡罩包装等)存在高度的可变性，甚至在据称来自同一制造商的抗生素中也是如此。例如，在收到的2个包装中，两种复方阿莫西林625 mg样品都标有“制造商X”;但是，这2个样品的包装和呈现方式不同(图2A).一些包装还包括警告标签，上面写着“只能凭注册医生的处方零售销售”，尽管这些包装是从不需要处方的渠道购买的。最后，2个吸塑包装还包括一个标志，说明“WHO GMP认证公司”(图2B)，尽管我们无法确认该认证的有效性或其来源(“WHO-GMP”认证可能表明来自印度马哈拉施特拉邦食品和药物管理局的认证)。如前所述，其他产品以破损的水泡包装运抵(图2C)。

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样品的分析测试

总共有45个独特的盒子或水泡包装的药物(来自12个制造商)，通过随机选择，从每包中分析3个药丸，相当于135个样品进行了分析测试。从网上药店购买的所有靶向抗生素都注明了药物名称，标签上注明其含有API，并且根据分析测试，含有所述API。然而，某些样品具有特定的风险特征，包括假定的污染物、药物相关化合物和未申报的原料药。

通过全球自然产物社会分子网络的分子网络被用于探索可能未在配方中列出的非靶向MS数据的差异。分子网络和随后对潜在危险因素的解释揭示了一种标记为八苯宗的特征，一种用于防晒产品的化学物质，至少在一家制造商的一个样品中(列出了西地那非API)和另一家制造商的4个样品中(列出了阿莫西林API;看到多媒体附件1有关更多详情)。常见的表面活性剂硫酸十二烷基和硫酸十四烷基分别在4个不同厂家的原料药中检出，分别为头孢氨苄、环丙沙星、阿莫西林和他达拉非。在分子网络中观察到的其他化学物质，我们认为是污染物，包括阻燃剂(三苯磷酸盐)、润湿和分散剂(四甲基-5-癸烯-4,7-二醇)和增塑剂。关于类药物化学物质，我们观察到一些与声称的API相关的化学物质(在分子网络中连接到API)，如地氯糖阿奇霉素以及其他未知的、未注释的化学物质。最后，西地那非样品还含有达泊西汀(通常用作治疗早泄的原料药)，这是一种未申报的原料药。

对于样本间的方差，采用无监督多元统计，特别是主成分分析(PCA)对药物制剂进行无目标质谱分析，分析正模态和负模态数据;在此过程中，我们比较了测试配方之间的全球化学特征(图3而且多媒体附件1）.在主成分分析的阳性模式下，根据主成分2(“PC2”)与主成分3(“PC3”)图面板中观察到的原料药(API)，观察到药物配方的分离，并对样品进行了明确的分组，表明某些制造商样品配方的一致性和其他不一致性(图3A).阴性模式数据的PCA结果显示阿莫西林和头孢氨苄的分组清晰，但其他药物制剂的分组不清晰，尽管总体而言，阴性模式下样品间的化学差异小于正电离模式。通过检测重复样品，进一步分析单个药品包装和制造商与PCA观察到的整体分离情况，表明样品化学相似性存在差异(多媒体附件1）.差异可能源于原料药数量的差异(本研究未完全评估)或所测配方中辅料和其他化学物质的差异。

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讨论

主要研究结果

我们的研究发现109个独特的网站在没有处方的情况下积极宣传常见抗生素的销售，导致27个在线受控测试购买订单，11个包装，以及总共1373个抗生素产品样品，使用视觉检查、分析化学和分子网络的组合进行了评估。在我们的抗生素销售网站样本中，有57个网站使用隐私服务掩盖了它们的位置或所有者地址，在那些订购的网站中，所有网站都要求提供额外的验证信息，以便有效地处理付款。

这些特征可能涉及与在线药品购买相关的消费者和产品安全风险因素，通常被认为是可能导致身份盗窃或欺诈交易的高风险交易特征。合法的邮购药店不表现出这些特征，而这些风险由于大多数网站缺乏第三方验证而进一步加强，正如我们在与Legitscript、NABP和MHRA验证交叉引用后发现的那样。事实上，在这项研究的过程中，用于测试购买的预付卡被欺诈收费(例如，在未经研究团队允许的情况下，预付卡上的食品订单被欺诈收费)，我们无法追回这些被盗资金。

在美国出货和收到的产品都来自海外，几乎所有的产品样品都来自印度。由于本研究的重点来自美国患者或消费者，这些抗生素代表了受控药物供应链之外的产品，具有更高的掺假、伪造或对人类健康有害的风险。几乎所有的产品都是用邮寄信封运输的，没有足够的保护来确保产品安全(一些产品似乎在运输中受损)，并且在标签上申报的货物通常不包括“药品”作为描述，而是被称为其他不相关的消费品，很可能是为了逃避海关检查。这些特征是未经授权和可能伪造的药物的明确警告信号。

最后，在使用MS对样品进行分析测试后，所有产品都被确定具有规定的API，尽管本研究没有定量测量每个被测样品中的API百分比。我们对配方进行了无监督的多元统计(如PCA)，这表明特定的制造商(如包装上所示)在其配方的化学成分上更精确，而其他制造商在测试的重复样品中表现出更大的变异性，这可能反映了不良或不一致的制造实践或质量。分子网络的使用还确定了样品中存在的其他杂质，这些杂质进一步证明了掺假的可能性，这可能会给患者带来独特的安全危害。

以往对处方药质量进行的研究通常得出如下结论:它们主要侧重于实地抽样，使用不同的流行度调查和分析技术，对主要在低收入至中等收入国家的实体机构销售的抗生素样品进行测试;他们使用包装分析或分析技术来检测从互联网上购买的非抗生素药物或膳食补充剂(如勃起功能障碍药物、生长激素、糖尿病药物、兴奋剂、膳食补充剂等);或者他们只是简单地描述不同的抗生素在线卖家，但不购买或测试这些产品[13，22-31]。我们的研究建立在这些先前研究的基础上，进行了多因素质量和安全分析，以产生与无处方提供者在线销售常见抗生素相关的潜在健康和安全风险相关的新数据点，这些数据点应通过额外的抽样和产品测试进一步确认。重要的是，所确定的许多潜在安全问题在更广泛的公共卫生和监管挑战的背景下是重要的，这些挑战旨在解决全球不合格和假药贸易、药物进口政策、确保供应链完整性以及使上市后监测和药物监管方法现代化[32]。

限制

考虑到所使用的方法，本研究也有一定的局限性。首先，基于网络的关于营销和药品可获得性的搜索查询有一定的局限性。首先，本研究中的搜索是在有限的时间范围内进行的，对在线可用性的评估也仅限于所描述的研究期间。然而，网站在互联网上是动态创建、修改和删除的，因此限制了我们结果的泛化性。此外，我们无法确定样品标签或吸塑包装上所述的制造商是否就是该产品的制造商，因为我们没有联系制造商确认药物批号或真实性。我们也不能完全确定，在研究团队收到产品之前，独立于在线药店，包装或样品质量的视觉检查是否退化、损坏或由于运输或存储问题而发生其他腐败，这可能影响质量测试和结果的外部有效性。

最后，虽然本研究关注的是与从“无处方”在线药店进口产品相关的风险，但本研究中确定的与抗菌药物相关的特定风险特征也可能与不同的制造标准有关，或者表明没有按照美国标准从美国以外的来源生产药物。未来的研究应纳入额外的在线药店对照组或对照组(例如，需要有效处方的国外在线药店)，以更好地了解与已识别的风险特征相关的因素。

结论

使用信息监测方法，例如使用结构化的基于网络的搜索查询，将结果与“秘密购物者”和在线测试购买联系起来，并评估卖家和产品的风险特征，有可能解决可能涉及非法行为者的其他在线健康挑战，例如非法销售其他处方药、受管制物质和非法药物，甚至是covid -19欺诈产品[11，33-35]。对这些努力至关重要的是建立共识和制定国际商定的标准和方法，以便在网上购买药物时进行初步风险评估[36]。可以根据现有工具，如欧洲药品质量理事会和亚太经济合作组织针对互联网销售的供应链安全工具包，为在线卖家甚至不同类别的药品量身定制全面和具体的风险评估;仿冒风险评估的加权标准，如Vida等人所建议的[36]，也是有益的。这项研究的结果还可以形成未来基于风险的多模式监测方法和产品质量评估方法的基础，这些方法可以扩展到更大的数据收集，以建立更普遍的发现。例如，未来的研究应考虑对世卫组织基本药物标准清单“观察”和“储备”抗生素进行测试，因为如果这些抗生素被伪造，它们可能产生更高的微生物耐药性和公共卫生影响。